Western blot提取蛋白时DTT和PMSF等蛋白酶抑制剂你真的了解吗？蛋白怎么煮最合适？
做Western blot的小伙伴都清楚，我们提取蛋白要加各种蛋白酶或磷酸酶抑制剂，这些酶的作用和发挥作用最佳浓度你真的了解吗？下面给大家一一盘点下。
DTT：二硫苏糖醇，一种很强的还原剂，易被空气氧化，稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命[1]。蛋白质二硫键（又称S−S键，由2个巯基-SH被氧化而形成）常作为活性中心发挥作用，是保持空间结构的重要官能团。为了确定蛋白质的一级结构，DTT可以将cys上的二硫键打开，使之成为线状多肽链，这样也便于抗体识别并结合特定的位点[2]。对于包埋于蛋白质结构内部的二硫键，DTT通常作用较弱，这类二硫键的还原需先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如盐酸胍、尿素或SDS）[3]。DTT在离子状态下才有作用，pH7-9.5时作用最强，pH降至3以下可终止其作用。PCR反应体系中加入DTT可以使蛋白质从DNA上释放出来，便于DNA和引物的结合，提高扩增效率。
使用浓度：DTT浓度太低起不到保护作用，浓度太高又会破坏结构。建议在0.5mM~1.5mM之间。有的抗体说明书会给出目的蛋白的最佳使用浓度。
PMSF：苯甲基磺酰氟。是一种丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂。难溶于水，且在水溶液中非常不稳定，容易分解，30min就会降解一半，因此提取蛋白时每一步都要加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h，补加一次。PMSF可溶于异丙醇、乙醇、甲醇、二甲苯和石油醚。有剧毒和腐蚀性。可抑制丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶），也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶[1]。室温下可保存一年。
使用浓度：0.1~1mM
NaF氟化钠：溶于水（溶解度10°C 3.66、 20°C 4.06、30°C 4.22、 40°C 4.4、60°C 4.68、80°C 4.89、100°C5.08）、氢氟酸，微溶于醇，有毒[1]。酸性磷酸酶可逆抑制剂，可抑制丝氨酸、苏氨酸磷酸酶，对碱性磷酸酶的效果较差，钒酸钠才能有效抑制[4]。
使用浓度：10~20mM
焦磷酸钠：溶于水，不溶于乙醇和其他有机溶剂。与Cu2+、Fe2+、Mn2+等金属离子络合能力强[1]。是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂。
使用浓度：1~2mM
正钒酸钠：正钒酸钠与钒酸钠为同一物质，化学式为Na3VO4 ，极易溶于水，溶液呈碱性，不溶于醇[1]。购买过来的一般是原钒酸钠，需要经过处理，使之变成单体才有效。磷酸酯酶抑制剂，可以抑制碱性、酸性磷酸酯酶，蛋白酪氨酸磷酸酯酶等磷酸酯酶，可逆抑制剂，也可以抑制Na+/K+ ATPase等ATPase。常用于抑制蛋白去磷酸化或促进蛋白的磷酸化激活，在提取细胞或组织蛋白时常用于保持蛋白的磷酸化状态[5]。
使用浓度：1mM
β-甘油磷酸(β-glycerophosphate)：是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂。
使用浓度：1mM
通常在提取到蛋白之后，还需要经过煮蛋白这一步，可能会有小伙伴奇怪了，为啥要“煮”蛋白呢？其实这是为了让SDS和蛋白充分结合，是蛋白质完全变性并解聚，形成棒状结构并带上负电荷，从而可以在电场中移动；SDS还能断开氢键，破坏二级和三级结构，使得蛋白质的电泳速度只跟分子量的大小有关。通常煮蛋白的条件是100℃，5min。但有一种特殊的需要用37℃孵育1h，或者60℃30min代替boiling5min，详情可以戳这篇推文：“师兄，help! help! 我的蛋白为什么一直检测不出来！”有的小伙伴也可能奇怪了，如果我煮蛋白时间过长过短会怎样呢？时间过短就不必细说了，肯定是反应不完全，如果一不小心煮蛋白时间过长，样品会蒸发很多，如果盖子崩开蒸发会更多，直接导致的一个后果是蛋白浓度定量不准确，其实笔者也挺好奇蛋白煮久了还有哪些其他后果。对于一些浓度大的蛋白样品可适当延长煮蛋白时间。
另外，煮蛋白后还可能会出现结块的现象，这种现象可能是由于蛋白样品浓度过高，已经超出了SDS可以结合的浓度，将样品稀释即可。
参考材料：
【1】百度百科
【2】https://wenku.baidu.com/view/b922554af7ec4afe04a1dfe8.html
【3】http://blog.sina.com.cn/s/blog_e4dda7bf0102x1jx.html
【4】丁香园
【5】https://china.guidechem.com/trade/pdetail10865209.html
【6】Vigushin DM et al. Trichostatin A is a histone deacetylase inhibitorwith potent antitumor activity against breast cancer in vivo. Clin Cancer Res.2001 Apr;7(4):971-6.
【7】http://www.meilune.com/goods.php?id=16464
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